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免疫沉淀(IP)的常见问题及解答

免疫沉淀(IP)的常见问题及解答

1. 用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验? 

答:抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同,和抗原以及Protein G或Protein A的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。 一般来说,多抗是沉淀反应最好的选择。另外,纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂?
答:从活性细胞裂解出来的样品中,往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,并且在低温下进行实验。

3. 溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么?
答:多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强表面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱表面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合。

4. 免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例?
答:每次沉淀实验之前,考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清;缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。

5. 免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液?
答:适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和;DOC(sodium de-oxycholate),SDS是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100,只加DOC或SDS,可能使抗体完全失去活性。